Для исследования Аральского моря и низовьев Сырдарьи Академия наук организовала экспедицию, поручив руководство ею зоологу Николаю Алексеевичу Северцову: для него «Средняя Азия сделалась научной целью всей жизни» после встречи (в 1845 г.) с Г. С. Карелиным. В конце лета 1857 г. Северцов начал из Оренбурга путешествие с большим караваном в сторону Эмбы по долинам Илека (система Урала) и Темира (приток Эмбы).
Обследовав Северные Мугоджары, он прошел к низовью Эмбы, где открыл выходы нефти (первые сведения о Приэмбинском нефтеносном районе), а затем он исследовал северный уступ плато Устюрт. Изучив Южные Мугоджары, он пересек пески Большие Барсуки, обогнув с севера Аральское море, и мимо озера Камышлыбаш вышел поздней осенью к Казалинску, на нижней Сырдарье.
Из 2,5 тыс. км маршрута около 1,5 тыс. было пройдено по местам, не посещенным натуралистами. Оттуда Северцов двинулся на юг, в пустыню Кызылкум, проследил сухое русло Жанадарьи (близ 44° с. ш.) и описал восточный берег Аральского моря. В конце 1857 г. он прибыл в Перовск (теперь Кзыл-Орда).
Весной 1858 г. Северцов прошел вверх по Сырдарье для изучения хребта Каратау, по пути делая зоологические сборы. Здесь он подвергся нападению и был захвачен в плен: «...кокандец ударил меня шашкой по носу и рассек только кожу, второй удар по виску, расколовший скуловую кость, сбил меня с ног – и он стал отсекать мне голову, нанес еще несколько ударов, глубоко разрубил шею, расколол череп... я чувствовал каждый удар, но странно, без особой боли...» Северцова спасли два других «кокандца», прекративших зверскую расправу. Раненый и больной Северцов пробыл месяц в плену в городе Туркестане, «...причем впервые ознакомился с южными предгорьями Каратау в самых неблагоприятных для наблюдений условиях». Он был освобожден в конце мая, после ультимативного требования русских военных властей; в начале сентября, окончательно поправившись, выехал в Петербург. По материалам экспедиции Северцов составил карты Арало-Каспийской степи, подробно описал рельеф, климат и растительность этого края, отметил процесс усыхания Аральского моря и первый определил древние границы между Каспием и Аралом.
В 1864 г., отказавшись от доцентуры в Киевском университете, он окончательно выбрал путь полевого исследователя-путешественника и, присоединившись к русскому военному отряду, продолжил изучение Тянь-Шаня, начатое П. П. Семеновым. Летом Северцов из Верного, перевалив Заилийский Алатау, прошел на запад до города Аулие-Ата (теперь Джамбул) вдоль северных склонов Киргизского хребта, лишь за год до этого (1863 г.) впервые снятого на карту военными топографами, изучая его геологию и рельеф. Затем он посетил Каратау и исследовал бассейны рек Талас (теряется в песках Муюнкум) и Чаткал (система Сырдарьи). Здесь он выявил два параллельных хребта – Каржантау и Пскемский. В 1865—1866 гг. он снова исследовал Каратау и бассейн р. Чирчика. В результате работ 1864—1866 гг. Северцов впервые установил геологическую связь хребтов между рр. Чу и Сырдарьей и доказал, что хребет Каратау (длина 420 км) является северо-западным отрогом Тянь-Шаня.
Осенью 1867 г. Северцов принимал участие в крупной Туркестанской ученой экспедиции. Следуя с небольшим отрядом из Верного, он обогнул с востока Иссык-Куль, перевалил хребет Терскей-Ала-Тоо у 77°40' в. д. и вышел к верховьям Нарына. При этом он дал классическую характеристику тянь-шаньского сырта: «...я увидел обширный великолепный вид на сырт: гряда за грядой поднимались на нем покрытые густым пожелтевшим дерном холмы, как взволнованное море; как пена на волнах, белели на них полосы снега. Что дальше, то выше поднимались холмы, все уступами над взволнованной степью, чаще и чаще становились на них снежные полосы, и широкой дугой замыкали горизонт с востока, юга и запада огромные зубчатые хребты, покрытые уже сплошным снегом, но и те поднимались волнистыми уступами. Солнце склонялось уже к закату, и освещенные снега дальних хребтов горели расплавленным золотом, рядом с которым тем холоднее казались густые, пурпурно-синеватые тени снежных же лощин...»
Северцов по снегу пересек сырты в юго-западном направлении и через несколько перевалов в начале октября снова вышел к Нарыну, затем на юге исследовал долины рек Ат-Баши (система Сырдарьи) и Аксай (бассейн Тарима) и проник в юго-западную часть хребта Какшаал-Тоо до 41° с. ш. Он был первым европейцем, прошедшим в эту часть Центрального Тянь-Шаня. Из-за сильных холодов к середине октября путешественник повернул обратно на север, к Нарыну, и через перевал Долон (у 75°40'), долину р. Джоон-Арык и Боамское ущелье в конце октября 1867 г. прибыл в Токмак, на р. Чу. Позднее по материалам, собранным во время этого первого пересечения Центрального Тянь-Шаня с юга на север, Северцов разработал орографическую схему Тянь-Шаня, под которым понимал «целую горную систему». Он пришел к выводу, что широкие тянь-шаньские долины представляют собой дно исчезнувших озер.