Женские монастыри существовали в Киеве еще с XII в. По древнему обычаю почти при каждом мужском монастыре находился и женский; например, при древнем Софийском монастыре — женский монастырь Святой Ирины, при Михайловском мужском — женская Богоявленская обитель, при Киево-Печерской лавре — женский Воскресенский монастырь. Таким образом, престарелые супруги, посвящавшие остаток своих дней Богу, жили хотя и в отдельных кельях, но неподалеку друг от друга.
Письменные сведения о существовании монастыря на Подоле, при Флоровской церкви, встречаются в грамоте польского короля Сигизмунда Августа, которую он дал в мае 1566 г. князю Константину Константиновичу Острожскому — киевскому воеводе. Этой грамотой польский король, по просьбе киевского протопопа Иакова Гулькевича, утвердил за последним право распоряжаться монастырем, освященным во имя святых Флора и Лавра, и «службу Божию в нем исправлять». О существовании монастыря говорит и записка Печерского монаха Иоанна (Богуша Гулькевича — внука и наследника протопопа Иакова), в которой он отказывается от своих прав на монастырь и предоставляет их игумении Агафии Гуменицкой и «законницам теперешним и на потом будучим». Эту записку утвердила грамота короля Владислава IV от 27 декабря 1655 г.
В означенных грамотах говорилось, что монастырь существует «здавна», но о судьбе его известно только то, что он был возобновлен протопопом Иаковом Гулькевичем; что при игумении Ульской деревянная монастырская церковь обветшала, но была исправлена и украшена игуменией Агафьей. Последняя для устранения тесноты выпросила у набожных людей, а также купила за деньги несколько ближайших мест, построила кельи и оградила монастырь «оплотом» (тыном).
В 1710 г. по повелению Петра I женский Воскресенский монастырь, стоявший напротив Святых ворот Киево-Печерской лавры, был закрыт, т. к. занимаемое им место понадобилось для устройства арсенала Печерской крепости. Находившихся там монахинь разместили во Флоровском монастыре; ему передали и все недвижимые имения закрытой обители, которых она особенно много получила при игумении Марии Магдалине — матери украинского гетмана И. Мазепы. С этого времени Флоровская обитель стала значительно улучшаться: так, в скором времени была заложена вместо тесной деревянной церкви новая каменная. В 1723 г. митрополит Рафаил освятил ее во имя Вознесения Господня.
В 1786 г. монастырские вотчины вместе с крепостными крестьянами были отобраны в казну, а монастырю, к тому времени возведенному в первый класс, было определено на содержание около 3565 рублей ассигнациями. Оставили обители еще две мельницы (в Хамбикове и Ходосовке), рыбное озеро, сенокос и 14 штатных служителей.
До 1811 г. все монастырские строения (кроме каменной Вознесенской церкви) оставались деревянными. Поэтому в случившемся в том году на Подоле пожаре все они сгорели, даже каменная Вознесенская церковь была повреждена. На восстановление обители по высочайшему повелению императора Александра I в 1812 г. было отпущено из казны 133 013 рублей ассигнациями. На эти деньги воздвигли большую часть каменных зданий — для проживания игумении и сестер обители.
В 1840 г. в обители начали возводить теплую каменную церковь во имя Казанской иконы Божией Матери с приделами во имя мучеников Флора и Лавра и святого апостола и евангелиста Иоанна Богослова. Пол в храме был мраморный, выписанный из-за границы и доставленный в обитель через Одессу.
В 1854–1857 гг. на монастырские деньги была возведена Троицкая церковь, при которой устроили кладбище. Впоследствии при ней были выстроены каменные церкви и исправлена дорога для въезда на крутую гору.
Монахини и послушницы от монастыря ничем не пользовались, кроме помещения, соответствующего их первоначальным вкладам в казну обители, и незначительной денежной помощи на дрова. Право же на жалованье, содержание и пособие из монастырских доходов предоставлялось только начальствующим в монастыре. Но высшее епархиальное начальство, сознавая неудобство такого положения, заботилось об учреждении для бедных монахинь и послушниц общей трапезы от обители. Этим можно было бы изжить многие неудобства, неизбежно возникавшие при отлучках монахинь на городские базары за продовольствием.
В XVIII–XIX вв. во Флоровской обители жили великие подвижницы. С 1758 г. здесь подвизалась княгиня Наталья Долгорукова — дочь Б. Шереметева (сподвижника Петра I) и жена попавшего в опалу князя И. А. Долгорукова. Вернувшись из ссылки в Березов, княгиня очень скромно устроилась в Москве и целиком посвятила себя воспитанию сыновей. А когда дети выросли, она перебралась в Киев и во Флоровском монастыре приняла постриг с именем Нектария. По преданию, свое обручальное кольцо Н. Долгорукова бросила перед постригом в Днепр.
Но несчастья не оставляли инокиню-княгиню и в монастыре. Младший сын ее Дмитрий сошел с ума от несчастной юношеской любви. Наталья Борисовна перевезла сына в Киев в надежде, что уединенная иноческая жизнь исцелит его. Но чтобы постричь молодого князя из знаменитого рода, нужно было согласие императрицы: оно было получено только в царствование Екатерины II, но оказалось уже не нужным. Молодой Долгорукий скончался в 1769 году; мать пережила сына на два года и скончалась в 58-летнем возрасте.
Около 1760 г. в Свято-Вознесенском (Флоровском) монастыре Александра Мельгунова — основательница Серафимо-Дивеевской обители, о которой будет рассказано в отдельной главе.
В 1917 г. одноглавый храм во имя Казанской иконы Божией Матери был перестроен под фабрику, а в 1929 г. Свято-Вознесенский (Флоровский) монастырь закрыли. Но уже в 1941 г. обитель возродили.
Старейшим из сохранившихся зданий обители является храм во имя святителя Николая Чудотворца. К западу от него расположился храм ротонда во имя Воскресения Христова, возведенный в 1824 г. в стиле классицизма.
К святыням монастыря относится келейно хранившаяся в нем в 1962–1992 гг. икона Божией Матери «Призри за смирение» — величайшая киевская святыня. От нее произошло исцеление глухонемой девочки, а в 1993 г. икона прославилась, тем, что ее негативный отпечаток проступил на стекле киота.